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　　第一讲 基因工程
　　考点导航
　　1．了解基因工程的诞生。
　　2．概述基因工程的原理及技术。
　　3．掌握基因工程的应用。
　　4．简述蛋白质工程。
　　知识网络
　　考点梳理
　　（一）DNA重组技术的基本工具
　　1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
　　（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
　　（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
　　（3）切割方式：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
　　2．DNA连接酶——“分子缝合针”
　　（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
　　（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
　　3．运载体（运输工具）：质粒 、噬菌体和动、植物病毒等
　　（1）必备的条件：
　　① 能在受体细胞中复制并稳定保存；
　　② 具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；
　　③ 具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择；
　　④ 对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。
　　（2）常用运载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。
　　(二) 基因工程的基本操作程序
　　1．目的基因的获取：
　　① 直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中调用目的基因；
　　② 以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库；
　　③ 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；
　　④ 化学合成。
　　获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。
　　2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建
　　（1）表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
　　① 复制起始位点即控制复制起始        
　　的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
② 　　启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录
③ 　　终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
④ 　　目的基因中的标记基因最少要有2个，1个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达，若受体细胞表现出该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。
　　（2）构建步骤：
　　①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。
　　②用，产生相同的黏性末端。
　　③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
　　3．将目的基因导入受体细胞