《DNA片段的扩增——PCR技术》学案

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  • 更新时间: 2011/1/18 19:29:06
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约5150字。

  《DNA片段的扩增——PCR技术》学案
  [课标要求]
  1.理解PCR的原理,讨论PCR应用。
  2.尝试PCR技术的基本操作。
  [知识梳理]
  一.背景知识
  1.细胞内DNA复制步骤:
  (1)在作用下解开DNA双链
  (2 ) 在作用下,以DNA单链为模板,合成一段;(两条DNA模板链各需一个RNA引物)
  (3 ) 以RNA引物为起点,在作用下,以为原料,按照碱基互补配对原则合成两条新链。
  2.聚合酶链式反应(PCR)概念;                                                     
  。
  3.PCR过程与细胞内DNA复制过程区别:
  (1)引物是人工合成的单链,20-30个脱氧核苷酸,而不是RNA。
  (2)  解旋通过对反应的控制来实现而不依靠。
  4.PCR过程:
  (1) 将PCR缓冲液、、一对引物、四种、DNA聚合酶、Mg2+等成分加入到特制的微量离心管中。
  (2) 高温变性:
  。
  (3) 低温复性:
  。
  (4) 中温延伸:
  。
  二.实践案例
  1.PCR实验虽然原理复杂,但操作十分简单,因为生物制剂公司已把PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液等组分配成了PCR试剂盒,实验人员仅需加入模板DNA及引物即可,所以快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。
  2.材料用具略
  3.活动程序
  (1) 加入各种试剂,混合,离心10s,放入PCR仪中。
  (2) 扩增循环,在PCR仪上设置好PCR热循环程序:
  循环数 高温变性 低温复性 中温延伸
  第一次 95℃,5min 55℃,1min 72℃,1min
  30次 95℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
  最后一次 ¬¬   —— —— 72℃,7min
  注:反应产物在4℃保存
  4.检测扩增效果
  (1)稀释样品10倍
  (2)以H2O作对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计读数调到零。
  (3)加入到厚度为1cm的比色杯中,测定260nm处的光吸收值
  (4)DNA浓度(μg/mL)=(A260nm/0.02)×稀释倍数
  三.探究活动
  PCR实验虽然操作简单,但实验设备及药品价格较高,可以利用自己准备的简易材料,设计并进行PCR技术的模拟实验操作。
  四.PCR技术意义
  PCR能,从而有效地解决了因为样品中DNA含量而难以对样品进行分析研究的难题,大大提高了对DNA分子的分析和检测能力,被广泛应用于、基因序列分析、遗传病诊断,古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等。
  五.小知识:
  1.DNA的两条链是反向平行的,为了明确地表示DNA的方向,通常将DNA的羟基(-OH)末端称为5’端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3’端延伸DNA链。但DNA合成的方向是从子链的5’端向3’端延伸。
  2.引物是一段RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
  3.在80ºC—100ºC的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。
  [复习指导]
  本节课复习要注重细胞内DNA复制过程和体外DNA片段的扩增——PCR技术的过程,运用DNA复制过程原理相同的方法,明确体外DNA片段的扩增——PCR技术在基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断,古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等方面的地位和作用。如何在体外创设细胞内DNA复制的条件是PCR技术的关键,细胞内的各种条件实际上是利用PCR仪来模拟的。PCR仪原理复杂,操作简单。
  [典例解析]
  1.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同,它们是()
  ①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链
  ②PCR过程不需要DNA聚合酶
  ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的
  ④PCR过程中,DNA不需要解旋,直接以双链DNA为模板进行复制
  A.①②③④B.①②C.①③D.②④
  [解析] PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同。第一,PCR过程需要的引物不是RNA,而是人工合成的DNA单链,其长度通常为20-30个脱氧核苷酸。第二,PCR过程中,DNA解旋不依赖解旋酶,而是通过对反映温度的控制来实现的。
  [答案] C。

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